小布实用Tips｜神经元活动依赖工具系列之二：Tet-on/off系统

时间：2023-06-09 16:26

# 原理 #

四环素（Dox）诱导基因表达系统的关键元件是四环素反应元件（TRE）和四环素阻遏蛋白（TetR）。经过多年发展，这一系统也经过了多次优化，现在常用的TRE是由7个长度为19个氨基酸的四环素抗性操纵子(TetO)组成，TRE及下游CMV启动子共同组成了四环素依赖性启动子（Ptet）。而对TetR的改造，使得多种Tet调控系统逐渐发展起来，应用最为广泛的便是抑制型系统Tet-off和激活型系统Tet-on。



Tet-off原理

tTA是由TetR和病毒转录激活域VP16融合而成的蛋白。生理条件下，tTA主动与TRE结合，启动基因表达；若给于Dox后，Dox与tTA的结合体与TRE解离，从而抑制基因表达。

Tet-on原理

rtTA是由rTetR和VP16融合而成的蛋白，它的表型与tTA相反。生理条件下，rtTA与TRE不结合，由于PminCMV缺少增强子，因此目的基因不表达；给于Dox后，Dox与rtTA的结合体与TRE结合，从而启动基因表达。

# 应用举例 #

四环素（Dox）诱导基因表达系统通常用于体外基因功能、体外基因治疗、蛋白质功能、以及mRNA功能研究，也用于体内实验研究[1]。在发育和病理研究中，Veron等建立了“Tet-on”诱导的肾小球足细胞血管内皮生长因子164（Podocyte VEGF164）过表达转基因小鼠，并利用其研究Podocyte VEGF164在发育的各个时期与肾脏病变的关系；在神经系统基本研究中，Blesch等在大鼠的阿尔兹海默症模型动物中利用“Tet-off”系统控制神经生长因子（NGF）的表达，实现了在大脑疾病模型中对神经营养因子的调控表达；在神经系统功能及机制研究中，Susumu Tonegawa等[2-3]研究人员利用“Tet-off”和“Tet-on”系统结合光遗传、化学遗传、钙成像等技术，在分子机制层面揭示了哺乳动物脑中记忆保护机制，为治疗伴随记忆丧失的阿尔茨海默症，以及伴随着顽固性创伤记忆的创伤后应激综合症（PTSD）等脑疾病提供了全新的药物开发思路；吴广延等在大脑层面研究并揭示了前额叶皮层中PrL神经元参与了通过控制注意力偏移来调节瘙痒行为的功能。



光遗传学

Susumu Tonegawa团队研究者[2]就利用“Tet-off”系统结合光敏蛋白对小鼠大脑中和恐惧记忆相关的记忆痕迹细胞进行标记；当这些被标记的记忆痕迹细胞被光激活后，正常小鼠就会回忆起这组细胞所编码产生的记忆。将AAV9-TRE-ChR2-EYFP病毒注射在c-fos-tTA转基因小鼠DG脑区，同时植入光纤，Dox的存在会抑制c-fos启动子驱动的tTA与其目标响应元件TRE位点的结合，从而阻止了ChR2-EYFP表达。小鼠进入新环境A中进行训练，诱导相关神经元表达c-fos，在没有药物的情况下，tTA-TRE系统可以工作（在加药的情况下，该系统是无法工作的），从而可以诱导表达ChR2-EYFP蛋白，ChR2就插入到了细胞膜，从而使得在这种情况下参与该学习记忆过程的细胞被ChR2-EYFP蛋白标记。研究表明，光遗传刺激海马印记细胞可以激活小鼠的恐惧记忆回忆。

Susumu Tonegawa表示在阿尔兹海默氏症（AD）早期阶段，患者通常并不会记起最近所经历的事情，这些记忆仍然储存在大脑中，只是患者没有获取的方法而已[3]。随后，他们将这种记忆印记细胞识别和光遗传学操作技术应用于7个月大的AD小鼠，以确定是否可以在疾病的早期阶段能恢复记忆。使用双腺相关病毒系统，将AAV9-c-Fos-tTA 和AAV9-TRE-ChR2-eYFP注射在7个月大的AD小鼠DG脑区，标记情景条件恐惧记忆相关印记细胞。尽管在DOX饮食中，DG神经元完全缺乏ChR2-eYFP标记，但是Dox停用1天足以在7个月大的AD小鼠和对照组小鼠大脑中稳定表达ChR2-eYFP，结果显示在早期阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，光遗传激活小鼠海马记忆印记细胞引起记忆提取。

基因编辑

清华大学生命科学学院管吉松等研究人员于3月27日在Nature Neuroscience杂志上发表了题为“Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 splicing and memory preservation”的文章[4]，发现了学习后记忆印迹相关神经元的活动会引起的表观遗传修饰，从而在记忆相关神经元中留下长期印迹。为了研究海马体中的组蛋白甲基转移酶Suv39h1是否对记忆的保存至关重要，但对记忆的编码或回忆无关，研究人员通过“Tet-on”系统选择性地敲除了海马体中的Suv39h1，利用慢病毒介导Dox诱导的 micro-RNA表达系统。Dox诱导显著降低了DG中Suv39h1的表达，结果表明下调Suv39h1（Suv39h1KD）并不影响训练1h后小鼠近期记忆的提取，提示Suv39h1缺失可能不影响记忆的编码。

钙成像+化学遗传学+光遗传学

陆军军医大学基础医学院吴广延等团队于2022年12月29日在国际学术期刊iScience上发表了题为“The prelimbic cortex regulates itch processing by controlling attentional bias”的研究论文[5]，研究者引入c-Fos标记体系和“Tet-off”系统，标记瘙痒特异性神经元和注意力相关神经元，结合钙成像记录被标记神经元的活动，通过光遗传学和化学遗传学调控神经元活动，探究大脑缘前皮层（Prelimbic cortex，PrL）中是否存在特异性参与调节瘙痒的神经元。将AAV9-c-Fos-tTA和AAV9-TRE-tight-jGCaMP7s混合注射于大鼠PrL区，注射病毒后，给大鼠喂食Dox饮食，以防止jGCaMP7s或EGFP的表达。注射病毒4周后，暂停Dox饲料喂养3天，注射5-HT致痒源，瘙痒特异性神经元被jGCaMP7s或EGFP标记。标记后立即恢复Dox饮食喂养，确保没有其他因素的干扰。在标记瘙痒特异性神经元的基础上，钙成像记录显示在瘙痒过程中，PrL瘙痒特异性神经元的活动明显升高。另外还借助Tet-Off系统配合化学遗传学特异性标记和抑制PrL瘙痒特异性神经元后，进一步操纵了PrL中的瘙痒反应神经元，动物的瘙痒-抓挠行为被显著抑制，证实PrL瘙痒特异性神经元确实参与调控瘙痒。

研究发现，Lena等[6]利用高容量腺病毒载体装载rtTA和tTS构成的Tet-on系统来表达红细胞生成素（EPO），并利用小鼠的组织特异性启动子来避免免疫反应，最终使目的基因在动物体内表达时间达到30周，这为长期的体内基因治疗提供了思路。四环素（Dox）诱导基因表达系统因为其具有高效、安全、严密、机理明确等特点，在基因治疗和研究中有非常广阔的应用空间。





参考文献

[1] 陈皓,夏海滨.四环素诱导调控表达系统的研究与应用[J].生命的化学,2011,31(02):285-291.

[2] Liu X, Ramirez S, Pang PT, et al. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 2012;484(7394):381-385.

[3] Roy DS, Arons A, Mitchell TI, Pignatelli M, Ryan TJ, Tonegawa S. Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer's disease. Nature. 2016;531(7595):508-512.

[4] Ding X, Liu S, Tian M, et al. Activity-induced histone modifications govern Neurexin-1 mRNA splicing and memory preservation. Nat Neurosci. 2017;20(5):690-699.

[5] Wu GY, Zheng XX, Zhao SL, et al. The prelimbic cortex regulates itch processing by controlling attentional bias. iScience. 2022;26(1):105829.

[6] Lena AM, Giannetti P, Sporeno E, Ciliberto G, Savino R. Immune responses against tetracycline-dependent transactivators affect long-term expression of mouse erythropoietin delivered by a helper-dependent adenoviral vector. J Gene Med. 2005;7(8):1086-1096.