小布速报 | 中科院徐富强团队开发新型AAV11载体实现高效的神经元逆行标记和星形胶质细胞转导

时间：2023-07-07 13:54

在目前的神经科学研究或基因治疗应用中，腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因其毒性低、应用范围广、基因表达丰度高和宿主免疫反应小等特性而成为体内基因递送的首选载体之一。能够高效逆行标记投射神经元的病毒示踪剂是解析神经环路的结构、功能以及治疗脑部疾病的有效载体。目前，一些基于衣壳蛋白工程改造的逆行示踪AAV已被广泛应用于神经环路的解析和操控，但在某些神经网络连接中，仍存在脑区选择性和逆行转导效率低等缺陷。此外，随着研究者对星形胶质细胞的关注，高效转导星形胶质细胞的基因载体也日益成为研发热点。



自然演化产生了众多的AAV血清型，为解决载体递送问题提供了丰富资源。尽管AAV血清型种类繁多，但仅有部分血清型被用作重组载体，例如常用的1、2、5、6、8、9等血清型，多数血清型尚未被广泛用作基因递送载体。鉴于此，中科院深圳先进技术研究院/精密测量科学与技术创新研究院徐富强团队建立了一系列自然演化血清型AAV的高效制备系统并进行系统的活体评估。2023年6月26日，在Nature Communications发表题为“AAV11 enables efficient retrograde targeting of projection neurons and enhances astrocyte-directed transduction”的研究论 文，将11型AAV开发为用于基因递送的重组载体，证实AAV11可经轴突末梢吸收高效逆行转导小鼠神经元，结合星形胶质细胞特异性启动子，可在特定脑区更有效地靶向星形胶质细胞，为神经科学研究提供了新的载体工具。

AAV 11 具有高效逆行标记能力

研究人员首先在尾壳核（CPu）立体定位注射rAAV11-EF1α-EGFP。发现在注射位点及其向前侧、向后侧均有荧光分布，在其上游脑区也可见清晰的神经元形态。这表明，rAAV11具有优异的逆行标记能力，可以通过轴突末端吸收并转导上游神经元的胞体。随后结合Ai14转基因动物证实AAV11未表现出顺行跨突触现象，说明AAV11的逆行标记效果是相对严谨的。



为了进一步评估AAV11逆行标记的性能，研究者将AAV11与被广泛用于逆行示踪的AAV2-retro做头对头的比较。将AAV11-EF1α-EGFP和AAV2-retro-EF1α-mCherry以等比例混合，并分别注射到腹侧海马（vHPC）、中脑 导水管周围灰质（PAG）或CPu等脑区。图1展示了当注射到vHPC脑区时，两种病毒都能在注射部位标记大量神经元（图1 b）。AAV11可以高效地标记来自海马CA3区（CA3）、联合核（RE）、梨状皮层内背核（EPd）、丘脑外侧背核（LD）和内侧隔复合体（MSC）的投射神经元，而AAV2-retro在相同区域内仅标记了少部分投射神经元（图1 c、d）。定量分析显示，AAV2-retro更倾向于逆行感染内嗅皮层（ENT），其转导效率显著高于AAV11。相反地，在其他上游脑区AAV11的逆行转导能力高于AAV2-retro，包括背侧海马（dHPC）、背侧丘脑中线集团（MTN）、EPd、LD和MSC等（图1 e）。

图1  AAV11与AAV2-retro在vHPC脑区介导的逆行转导效果比较

随后研究人员进一步验证排除了竞争效应、批次效应及荧光蛋白亮度等因素带来的偏差，证实了AAV11载体具有稳健的逆行标记能力，在特定环路的标记效果上与AAV2-retro互补或优于AAV2-retro，并经实验初步地推测二者的逆行标记差异可能是由于对不同神经元入胞转导差异所致。



AAV 11 可应用于神经环路功能监测

团队进一步采用双病毒载体和单病毒载体策略检验了AAV11在神经环路功能监测中的效用。从VTA到NAc的多巴胺能投射神经元在工作动机和奖励驱动学习中被激活。对于双病毒载体策略，将AAV11-Cre载体注射到NAc，同时将Cre诱导的AAV9-GCaMP6m载体注射到C57BL/6小鼠的VTA（图2 a）。将蔗糖溶液放置在行为箱中作为小鼠的奖励（图2 b）。如预期一致，在小鼠舔舐糖水时，NAc投射的VTA神经元被激活（图2 c），相应地，记录到钙信号的增加（图2 d、e）。对于单病毒载体策略，将AAV11-hSyn-GCaMP6s载体注射到NAc并在VTA上方植入光纤（图2 f）。与双病毒策略一致，在奖励刺激后也检测到钙信号的增加（图2 g）。这些结果表明，AAV11载体可用于神经环路的功能监测。

图2  AAV11可用于神经环路功能监测

AAV 11  可高效转导星形胶质细胞并用于解析神经元-星形胶质细胞连接

除神经元外，神经系统中另一类重要的细胞是胶质细胞，其中星形胶质细胞维持神经元群体的稳态，并与多种神经系统疾病的发生密切相关。因此，开发高效靶向星形胶质细胞的AAV具有重要意义。为了评估AAV11对星形胶质细胞的转导效果，携载星形胶质细胞特异性启动子GfaABC1D驱动绿色荧光蛋白报告基因EGFP的AAVA11载体被注射在海马齿状回（DG），发现EGFP在DG脑区星形胶质细胞中广泛表达，这证实了AAV11存在有效转导星形胶质细胞的能力。



AAV8和AAV5是已被广泛使用的具有星形胶质细胞转导嗜性的血清型。为了评估AAV11对星形胶质细胞的转导效率，将AAV11分别与AAV8与AAV5在特定脑区进行星胶转导效率比较。定量分析表明，AAV11比AAV8和AAV5在特定脑区更有效地靶向星形胶质细胞（图3 a-g）。



已有研究证实AAV1的顺行跨突触特性可实现经神经元轴突末梢到星形胶质细胞的转导，这可用于研究神经元-星形胶质细胞间的连接。鉴于AAV11既可以高效逆行标记投射神经元又可高效转导星形胶质细胞，研究人员将AAV11与AAV1配合使用，从而标记出轴突-星形胶质细胞连接的精细结构（图3 h、i）。在此系统中，团队设计多病毒载体策略更清晰地展示了特定脑区神经元-星形胶质细胞间的连接。这项工作展示了AAV11作为新型病毒工具用于研究神经元-星形胶质细胞连接的应用潜力。

图3  AAV11高效转导星形胶质细胞并用于解析神经元-星形胶质细胞连接

总 结

本研究开发了新型AAV11病毒载体，证实其在小鼠中表现出相对高效严谨逆行标记投射神经元的能力，与常用作逆行示踪剂的AAV2-retro相比展现出互补性标记优势，结合光纤记录可用于环路功能监测，另外AAV11可高效转导星形胶质细胞并用于解析神经元-星形胶质细胞连接。作为一种有着工程升级空间的自然血清型，AAV11可应用于神经科学基础研究，并有潜力在将来应用于基因治疗。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-39554-7



中科院深圳先进技术研究院/精密测量科学与技术创新研究院徐富强研究员与中科院深圳先进技术研究院林坤章助理研究员为该论文共同通讯作者，中科院精密测量科学与技术创新研究院/深圳先进技术研究院韩增鹏博士与华中科技大学武汉光电国家研究中心骆能松博士为该论文共同第一作者。研究得到国家科技创新2023“脑科学与类脑研究”重大项目、国家自然科学基金、广东省重点领域研发计划、中国科学院战略性先导科技专项、深圳市生物医药病毒载体重点实验室、广东省药品监督管理局病毒治疗制剂质控技术重点实验室等经费支持。



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其不仅表现出高效逆行标记投射神经元的功能，还能通过表达各种功能元件(Cre重组酶或钙敏感功能探针等)来监测神经元活动。值得注意的是，rAAV11还能高效且高特异性靶向星形胶质细胞。

这些特性使rAAV11在基因治疗、神经环路结构和功能解析、神经退行性疾病的环路研究等领域，具有广阔的应用前景。



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